316L不锈钢表面钽沉积生物相容性的研究

2020-01-29 11:39:41

   此次研究的目的是验证医用316L不锈钢表面钽沉积后生物相容性的变化。方法是采用在医用316L不锈钢表面进行钽沉积,之后将大鼠骨髓基质干细胞分别植入钽沉积表面和316不锈钢基底表面,分别进行X射线衍射检测材料表面钽沉积量、两种材料表面细胞形态观测、细胞黏附率检测、碱性磷酸酶活性检测。结果:经X射线衍射检测钽有效的沉积于医用不锈钢316表面;细胞于两种材料表面生长良好;24小时细胞黏附率钽沉积表面高于316不锈钢表面(P<0.05);经过5天连续细胞培养,钽沉积材料表面大鼠骨髓基质干细胞的活性高于316不锈钢材料表面(P<0.05)。结论:316医用不锈钢经过钽沉积后其表面生物相容性高于其本来材料。


  医用金属材料,由于其优良的物理化学性能和生物相容性而被广泛的应用于医学临床领域,尤以口腔和骨科为甚。临床上常用的医用金属材料为316钴钼合金、钛合金、纯钛等。其中,由于316L不锈钢的价格低廉且易于加工而被广泛的应用。但近年来的研究发现,与其他大部分医用金属一样,316L不锈钢的生物相容性并非完美。其应用于临床时会有部分组织排斥的现象出现。现在对于生物相容性的研究,学者们发现金属钽具有几乎近于完美的生物相容性,且将其应用于临床后发现其临床效果极佳。受限于钽高昂的价格,钽的临床应用增加了患者的负担。在本研究中,拟以316L不锈钢为基底,通过化学气相沉积技术使金属钽在316L不锈钢面沉积,并对沉积钽后的材料进行生物相容性评价,对其临床应用前景进行评估。



一、材料制备


  将直径为1cm、厚度为2mm的圆形316L不锈钢片表面抛光,超声波清洗,干燥后备用,将五氯化钽置于陶瓷坩埚内,同处理后的316L不锈钢片分别置入化学气相沉积机的反应管内,载气为氩气,还原气为氢气,反应温度为800℃,沉积时间为2小时。将沉积后的材料取出后备用。


1. X射线衍射检测


  将经过钽沉积的金属片放于扫描镜的载物台上,经表面喷金后进行X射线质谱分析,已确定沉积层的物理成分。


2. 骨髓基质干细胞分离培养


  将1只4周龄大鼠脱颈处死后,无菌取出双侧股骨,PBS冲洗,去除表面的多余组织,在无菌条件下,去除股骨两端,用含20%FBS的DMEM培养基冲洗骨髓腔,将冲洗液收集,置于25平方厘米培养瓶中,首次24小时换液,3~4天传代,扩增细胞后备用。


3. 细胞黏附实验


 将两种金属片清洗干燥后备用,将培养瓶中的骨髓基质干细胞消化、吹打、离心、重悬,调整细胞密度为1×104个/mL。取次细胞悬浮液200μm分别植入两种金属表面,依靠表面张力使液体不外流,置于细胞培养箱中连续培养24 h后,PBS冲洗,将金属片表面的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后,吹打下来,进行细胞计数,分别计算两组材料表面细胞24小时黏附率,并进行统计学分析。


4. 材料表面细胞形态学观察和碱性磷酸酶活性检测


  将细胞分别接种于两种材料表面,在培养的第3天,分别取出两种材料,对材料表面的细胞进行用PBS清洗,多聚甲醛固定,酒精梯度脱水干燥,在金相显微镜下观察材料表面细胞生长状况,并照相记录。在培养的第5天将两种材料取出,PBS清洗,Trion100裂解细胞,将裂解液收集进行碱性磷酸酶检测(南京建成生物技术研究所碱性磷酸酶检测试剂盒)。


二、结果分析


1. 材料表面基质干细胞形态学观察


  在两种材料表面生长的基质干细胞为圆形、多角形或梭形,胞浆比例大,胞质透明,胞核圆形,生长状态良好。


2. 细胞黏附实验


  经过24小时细胞黏附检测,钽沉积材料表面的细胞黏附率为(93.34±1.72)%,316不锈钢表面为(85.63±1.53)%,差异有统计学意义(P<0.05)。


3. 材料表面细胞碱性磷酸酶活性检测


  经过5天材料表面细胞培养后,经碱性磷酸酶检测,钽沉积材料表面的大鼠骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活性为(115.32±3.27),316不锈钢表面为(81.23±3.35),差异有统计学意义(P<0.05)。


   医用金属材料由于具有良好的物理学性质且价格低廉,被广泛的应用于医用材料领域,用来进行硬组织缺损的修复、骨折的固位、关节的替代等。但由于机体免疫系统的存在,对于金属材料的植入难免会发生或多或少的免疫排斥反应,使材料在机体内发生腐蚀或被吸收,使手术植入失败。近年来,对于金属材料的生物相容性研究成为生物学材料研究的热点。316医用不锈钢作为传统的医用材料具有优良的生物学性能,但与金属钽相比,其生物相容性较差。金属钽是一种硬度较高、密度较大的金属材料,其物理性能稳定。在常温下,对盐酸、浓硝酸及“王水”都不反应,有金属陶瓷之称。但是由于其价格昂贵,加工相对困难,而限制了其在临床上的应用。


  本实验中,笔者通过化学气相沉积技术是钽沉积于316医用不锈钢表面,通过X射线衍射试验发现此沉积层钽含量极高,且性质稳定。此项检测的目的在于对不锈钢表面的钽沉积层质量进行评估,由于实验条件的限制和加工工艺的局限,钽沉积层在基材表面的沉积是不均匀的,如果在生物实验前不进行钽含量检测,则无法保证316L不锈钢为钽所有效覆盖。经过检测笔者发现沉积层的成分为纯钽。由于钽有效的覆盖了316不锈钢表面,使经过钽沉积后的316L不锈钢材料表面具有钽的性能,这样在不大幅提高材料成本的情况下理论上可以大幅提高材料的生物相容性性能。在实验中,为证实此种假设,笔者对材料采用了细胞黏附率的检测和碱性磷酸酶活性的检测。由于材料植入体内后,首先和细胞接触,细胞和材料的早期接触特性,即细胞的黏附率决定了材料的早期生物相容性,故对于黏附率的检测来评价生物相容性是有着重要的意义。其次,由于金属材料在临床应用中大部分被用于硬组织,所以,本实验检测了碱性磷酸酶的活性,以此来评估材料的骨组织结合特性,为临床应用提供数据支持。通过这两种生物学检测,笔者发现316L不锈钢表面经过钽沉积后,有效地提高了其生物学性能,进而拥有广阔的应用前景。


  对于钽在不锈钢表面的沉积依然有许多问题要解决。首先,对于抗磨性的研究,由于本实验条件所限并未涉及,但对于临床上的关节替代研究领域、抗磨性的研究为一中重要研究领域。其次,对于钽沉积厚度和沉积时间两者相关性的研究也为钽沉积材料临床应用研究的一个重要领域。总之,由于钽本身所具有的优良的生物学性能,通过薄膜技术将其分布于各种基材表面进而改变基材的生物学性能是大范围提高临床材料生物相容性的有效手段。


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